高效液相色谱法检测蜜饯中甜蜜素实验方法

    一、实验目的
    1.检测蜜饯中的甜蜜素含量
    2.验证并重现文献中关于甜蜜素检测的方法，并有针对性的作出改进。
    二、实验原理
    在酸性的介质中，甜蜜素经次氯酸钠溶液衍生，正己烷反相萃取衍生物N,N-二氯环己胺，在314nm波长下有最大吸收。
    三、实验材料、试剂耗材及仪器设备
    1.实验材料
    某品牌珍珠梅
    2.试剂耗材
    2.1甜蜜素标准品乙腈(国药色谱纯)；超纯水(自制)；硫酸(优级纯)；次氯酸钠(有效氯含量超过5%)；正己烷(色谱纯)；针式过滤器(有机系和无机系)
    2.2工作液
    2.2.1甜蜜素母液：精确称取1.0000g甜蜜素标准品，置于100ml容量瓶中加水定容，配制成10.00mg/ml的母液
    2.2.2硫酸溶液(1：1)：取10ml超纯水于50ml烧杯中，另量取10ml浓硫酸小心加入到水中，边加边搅拌，待温度降至室温后使用。
    2.2.3甜蜜素工作液：取甜蜜素母液，分别用水稀释成0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00mg/ml的标准工作溶液。
    3.仪器设备
    安徽皖仪LC3100梯度系统高效液相色谱仪(可变波长紫外检测器)；超纯水机(安徽皖仪)；高速离心机；超声波清洗器；漩涡混合器
    四、实验方法及步骤
    1.实验方法
    1.1制作系列梯度的甜蜜素标准工作曲线
    1.2样品衍生化，检测浓度
    1.3利用高效液相色谱法检测甜蜜素含量
    色谱条件如下：
    色谱柱：C18(2),4.6*250mm，5um
    流动相：乙腈：水=80：20流速：1ml/min
    进样量：20ul柱温：40摄氏度
    波长：314nm
    2.实验步骤：
    2.1标准工作曲线建立
    2.1.2分别精确吸取10ml甜蜜素标准工作液至50ml的带盖的玻璃瓶中
    2.1.3分别加入2ml硫酸溶液(1：1)，5ml正己烷，1ml次氯酸钠溶液，旋紧盖子漩涡震荡1分钟
    2.1.4吸取上层的有机相转移到另一只玻璃瓶中，加入30ml超纯水，漩涡震荡1分钟
    2.1.5重复一次水洗过程，吸取上层有机相，0.45um滤膜过滤后进样检测
    2.1.6根据检测数据，以样品浓度为横坐标，检测器的响应值为纵坐标建立标准工作曲线
    2.2样品测定
    2.2.1取10g的样品的果肉，用剪刀将其剪碎，置于100ml的烧杯中，加入50ml超纯水，浸泡2小时，在此期间每隔30分钟用玻璃棒搅拌一次。
    2.2.2取上清液高速离心或用0.45um的滤膜过滤
    2.2.3移取10ml离心或过滤后的溶液按照上述标准品的衍生方法处理，如果样品中的甜蜜素含量过高可稀释至合适的浓度，本实验根据实际情况将上清液稀释10倍，
    2.2.4吸取衍生处理后的有机相层过滤，取20ul注入液相色谱仪检测
    2.2.5根据实验数据采用外标法定量。
    五、实验数据
    1.甜蜜素标准品谱图相关信息
    1.1标准品谱图
    1.2甜蜜素系列浓度标准品叠加图
    1.3标准工作曲线
    2.样品谱图信息
    序号文件名峰面积保留时间峰高半高峰宽浓度
    1样2(稀释10倍)12327267.3341685212.96755.73546
    2样2(稀释10倍)22249187.3591681712.55853.79997